研究者たちは、レムデシビルは修飾アデノシンアナログなので内因性リガンドであるアデノシンと同じように、Gタンパク質共役受容体 (GPCR)を活性化するのではないか?と仮説を立てました。

はじめに、Gタンパク質共役受容体 GPCR の活性化を一度に多数を検出するシステムを使いました。[このシステムについての大学によるプレスリリースはこちら、Nature Methodsの論文はこちら]

最初はスクリーニングにキメラGαサブユニットを使い、レムデシビルが GPCR の中で、ウロテンシンII受容体 (UTS2R = GPR14) を選択的に活性化することを突き止めました。ウロテンシンII受容体は特に心血管系の細胞膜に多数発現し血管収縮などの作用があります。
なお、レムデシビルは静脈内に投与されると速いスピードで代謝され、図2にある RNとRTPに変化します。良い情報として、RNとRTPは両方ともウロテンシンII受容体に作用しませんでした。

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図2. 想定されるレムデシビルの代謝経路 doi: 10.1038/s41401-020-00537-9


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次に、ウロテンシンII受容体 (UTS2R) とレムデシビルのドッキング モデル です (下図)。ウロテンシンII受容体 の AlphaFold 構造は緑色のリボンです。レムデシビルと受容体の選択された側鎖は棒で示され、それぞれ灰色と緑色に色付けされています。黒い破線は水素結合を示します。

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上図にある3つのアミノ酸 (T304、N297、M134) を変異させるとレムデシビルによる活性化が完全に消失しました。N297がレムデシビルのマクギガン部分と相互作用し、M134 および T304 はヌクレオシド部分と相互作用します。一方、これら 3 つの残基とは対照的に、D130 はレムデシビルと UTS2R の結合に対して阻害効果がありました。

以上の事実は、レムデシビルが単純なアデノシンの代わりではなく、UTS2Rとユニークな結合作用を持つことを示しています。

レムデシビル媒介のUTS2R活性化は薬物媒介性心毒性の根底にある

UTS2R発現HEK293細胞をレムデシビルで刺激し、細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)1/2のリン酸化状態を調べた。レムデシビルを最長72時間適用すると、ERK1/2の長期持続的で用量依存的なリン酸化が誘発された(図3a、図S3a)。重要なことに、レムデシビル媒介ERKリン酸化はUTS2Rアンタゴニストによって廃止された(図3a、S3a )。レムデシビルによって誘導されるERK1/2の応答は、UT2によって誘導される応答と同様でした(図S3b)。

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図3c-e




図 3: レムデシビル媒介 UTS2R 活性化の心毒性作用。

a UTS2Rを過剰発現する血清欠乏HEK293細胞を、UTS2Rアンタゴニストであるウランチドの存在下または非存在下で、示された濃度のレムデシビルで5分間刺激し、溶解物をウェスタンブロッティング分析に供した。ERK1およびERK2活性化比(pERK1/ERK1およびpERK2/ERK2)は、ビヒクルに対して正規化されたデータを使用して計算されました。b左、表面 ECG 上の電場電位持続時間と QT 間隔の間の時間相関。右、多電極アレイ (MEA) プラットフォームの概略図。cウランタイドの存在下または非存在下で 1 μM レムデシビルで 72 時間処理したヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞 (hiPSC-CM) の代表的な電場電位波形。d hiPSC-CMにおける電場電位延長に対するレムデシビルとウランチドの効果。* p  < 0.05、** p  < 0.01 (二元配置分散分析とそれに続く Šídák の多重比較検定による)。e電流クランプモデルにおけるhiPS-CMの自発的活動電位を記録するための穴あきパッチクランプ。hiPSC-CM を 50 μM ウランチドの存在下または非存在下で 10 μM レムデシビルで 72 時間処理しました。* p  < 0.05 および ** p Tukey の多重比較テストによる < 0.01。データは平均値 ± SEM ( n  ≥ 3) として表されます。


UT2およびその受容体UTS2Rは組織内で広く発現されており、心血管系では比較的高い発現が見られる (33) (図S3c,d)。レムデシビルの心毒性の可能性 (10-13) に促されて、我々は心筋細胞機能に対するレムデシビルの影響を評価しました。ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞 (hiPSC-CM) (34)を 使用して、電場電位(FP)に対するレムデシビルの効果を調べました。UTS2Rの発現レベルはヒト心臓の発現レベルに匹敵します(図S3e )FP持続時間(FPD)は、心電図(ECG)(35)上のQT間隔と密接に相関する(図S3b左)。注目すべきことに、QT間隔の延長は、重篤で潜在的に致死的な不整脈の発生と関連しており、QT延長は薬物誘発性心血管毒性の主な原因である(36)。FPD の評価では、細胞集団レベルで心筋細胞の電気生理学をモニタリングできる多電極アレイ (MEA) プラットフォームの使用が広く受け入れられています (図 3b右) (35)。MEA分析により、レムデシビルで処理したhiPSC-CMは、それぞれ24時間で1.32±1.38%、48時間で5.60±1.60%、72時間で15.57±3.49%の長期FPDを示したことが明らかになった。注目すべきことに、延長はUTS2Rアンタゴニストによって有意に抑制された(図3c,d)。実際、UTS2R アンタゴニストとレムデシビルの併用では、24 時間 (-1.71 ± 1.60%) および 48 時間 (-0.61 ± 0.11%) では FPD 遅延がほとんど示されませんでしたが、逆転効果は依然として顕著でしたが、72 時間では部分的になりました (図.3d )
FPDに加えて、穴あきパッチクランプによるQT延長を評価し、hiPS-CMの自発的活動電位を記録しました。APD 90 (90% 再分極時の活動電位持続時間) を測定しました。レムデシビルは、hiPS-CMにおけるAPD 90 を有意に延長させたが、この延長はウランチドの投与により顕著に減弱した(図3e)。したがって、これらの結果は、報告されているレムデシビルの催不整脈リスクのこれまで知られていなかったメカニズムを解明する (11,12,13)。少なくとも部分的に UTS2R に依存しています。次に、心臓の収縮性に及ぼすレムデシビルの効果を評価しました。この目的のために、新生児ラット心筋細胞 (NRCM) を使用し、収縮力を評価しました。一定のペーシングプロトコルの下では、慢性的なレムデシビル治療を受けたNRCMは収縮性の低下を示しましたが、UTS2Rアンタゴニストによって大幅に減弱されました(図4a)。

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図 4: レムデシビル媒介 UTS2R 活性化の心毒性作用。

ab左、ウランチドまたはb百日咳毒素 (PTX)、Gα i/o阻害剤、および YM-254890、a Gα qの有無にかかわらず、1 μM レムデシビルによる新生児ラット心筋細胞 (NRCM) のペーシング下の収縮性の代表的な波形。/11阻害剤、48 時間。右は、 NRCM のペーシング下の収縮性に及ぼす、ウランチドまたは b PTX および YM-254890 を併用レムデシビルの効果。 Tukey の多重比較検定による** p  < 0.01、*** p  < 0.001、**** p < 0.0001。データは平均値 ± SEM ( n  = 3) として表されます。cdc ERK1/2 およびdプロテインキナーゼ B (AKT)のリン酸化に関する代表的なウェスタンブロット。UTS2Rを過剰発現する血清欠乏HEK293細胞を、示された濃度のレムデシビルで48時間刺激しました。G i/oタンパク質阻害の場合、細胞を 150 ng/mL の PTX とともに少なくとも 18 時間インキュベートしました。ERK1、ERK2、および AKT 活性化率は、ビヒクルに対して正規化されたデータを使用して計算されました。 Tukey の多重比較検定による* p  < 0.05、** p  < 0.01、*** p < 0.001。データは平均値 ± SEM ( n  = 3) として示されています。ef成体マウス心筋細胞の収縮性に及ぼすレムデシビルの効果。単離された成体マウス心筋細胞をレムデシビル (10 μM) で 30 分間処理し、電気ペーシング中に細胞面積のパーセンタイル変化 ( e ) と心筋細胞短縮率 ( f ) を測定しました。****対応のないt検定によるp  < 0.001 。データは平均値 ± SEM (3 匹のマウスからの合計 54 個の細胞) として示されています。

Gα s、Gα i/o、Gα q/11、およびGα 12/13を含むヘテロ三量体Gタンパク質は、GPCRの下流エフェクターです。それらの中で、Gα i/oファミリーは、イオンチャネルの調節を介して心筋の収縮性と心拍数に関与していると考えられています(37)。UTS2RはGα i/oおよびGα q (29) に結合しているため、どのGαタンパク質がレムデシビル媒介の心筋収縮の減少に関与しているかを決定しようとした。Gα i/o阻害剤百日咳毒素 (PTX) は、レムデシビルの効果を完全に遮断し、NRCM のピーク収縮を回復しましたが、 Gα q/11阻害剤 YM-254890 はそうではありませんでした (図 4b)。


以前の研究では、NRCMにおけるGα i/oの活性化がどのようにGβγの遊離につながり、細胞内でPI3Kを活性化し、AKTおよびERK1/2の活性化につながるかを実証した(38)。この観察と一致して、Gα i/o阻害は、レムデシビルによって誘導されるERK1/2およびAKTのリン酸化を減少させた(図4c,d)。これらの結果は、レムデシビルが、Gα i/o依存性のAKT/ERKシグナル伝達経路を介して心筋細胞の収縮性を低下させることを示唆している。まとめると、我々の結果は、レムデシビル自体がUTS2Rの外因性リガンドとして機能できることを示しています。さらに、我々は、レムデシビルの不整脈促進性および陰性変力作用の可能性を特定しました。これらは両方とも UTS2R 依存性です。

新生児の心筋細胞は最終分化していないため、成体マウスの心臓から単離された成熟心筋細胞に対するレムデシビルの効果をさらに調査しました(図S3f)。心筋細胞の収縮はペーシング条件下で記録され、収縮の程度は形態学的分析によって評価されました。新生児心筋細胞と同様に、レムデシビルは成人心筋細胞の収縮を著しく阻害した(図 4e,f)。
以前の研究では、レムデシビルの活性型が高用量でミトコンドリアRNAポリメラーゼ(mtRNAP)に対する阻害効果を示すため、レムデシビル関連の心毒性はミトコンドリア機能不全によって引き起こされる可能性があることが示唆されている(39)。しかし、ヒトにおけるレムデシビル投与後の最大血漿濃度に等しい10μMのレムデシビルによる治療27は、ミトコンドリア呼吸複合体タンパク質の定常状態レベルに影響を与えなかった(図S3g.h)。

レムデシビル媒介UTS2R活性化の遺伝的影響

ヒトにおけるレムデシビル-UTS2Rシグナル伝達に対する感受性に対する遺伝的多様性の影響を理解するために、我々は、大規模な集団ベースのゲノム情報である14KJPNゲノム参照パネルを含むゲノムデータベースから一塩基変異体(SNV)情報を抽出しました。 14,000 人の日本人の DNA 配列から構築されたデータベース41と、それに続く受容体の活性化に関する機能アッセイ。UTS2R遺伝子座では合計 2,178 個の変異体が報告されており、そのうち 139 個の変異体はミスセンス変異体です (補足データ 2 )。14KJPN にリストされているかなりの数のミスセンス SNV が、より広範な民族の SNV を含む gnomAD データベース ( https://gnomad.broadinstitute.org ) でも報告されています。
したがって、我々は、UTS2R遺伝子のヒト SNV に対応する 110 個のミスセンス変異体を生成しました。N 末端の構造予測の信頼度スコアが比較的低かったため、UTS2Rの 5' 領域の 29 個のミスセンス変異を除外しました。110個のミスセンスSNVのうち、44個のSNVは、WT受容体と比較してレムデシビルに対する感受性の低下を示した( ⊿pEC 50 <-0.3、これはWT受容体と比較して2倍を超えるEC 50 増加に相当する;図5a 上部パネル)。一方、47のSNVはWT受容体と比較してUT2に対する感受性の低下を示し、そのうち18のSNVはレムデシビルに対する感受性の低下を示したSNVと重複していました(図5a下のパネル、図S4a)。特に、 WT受容体と比較してレムデシビルに対する受容体感受性を高める可能性がある4つのミスセンスSNV(G68 1.49 C、D130 3.32 G、V159 34.54 M、およびA249 ICL3 G)を発見しました( ⊿ pEC 50  > 0.3、これは<に相当します) WT 受容体と比較して EC 50が0.5 倍減少; 図5a-c )。さらに、これら 4 つの機能獲得レムデシビル感受性 UTS2R SNV のうち、G68 1.48 C および D130 3.32 G 変異体は逆に UT2 に対する感受性の低下を示しましたが、V159 34.54 M および A249変異体は逆に UT2 に対する感受性の低下を示しました。ICL3変異は、UT2感受性の中程度またはわずかな増加を示した( ⊿pEC 50  < 0.3;図5c、図S4a )。まとめると、結果は、UTS2R遺伝子に G68 1.49 C、D130 3.32 G、V159 34.54 M、または A249 ICL3 G 変異を持つ個人はレムデシビルに対して感受性があり、対立遺伝子の頻度は低いものの、UTS2R 媒介性心毒性に対してより感受性が高い可能性があることを示唆しています。機能利得バリアントの割合は低いです (図S4b )。

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図 5: レムデシビル媒介 UTS2R 活性化の遺伝的影響。


a TGFαシェディングアッセイで測定した、(上のパネル)レムデシビル媒介受容体活性化および(下のパネル)UT2媒介受容体活性化に対するUTS2R遺伝子由来の110個のミスセンスSNVの影響。y軸 ( ⊿ pEC 50値)は、WT 受容体と比較した各変異体受容体の相対的な活性化能力を表します。⊿ pEC 50カットオフ値は、破線で示すように -1 に設定されました。水色のバンドは、-0.3 <  ⊿ pEC 50  < 0.3 の範囲を表し、EC 50 の 0.5 倍から 2 倍 (2 倍未満) の変化の範囲に対応します。WT受容体と比較した変異受容体の。すべての実験は 3 回実行され、データは平均値として表されます。b変異の位置とレムデシビルの効力に対するそれらの影響を示すUTS2Rのスネークプロット図(www.gpcdb.orgから改変)。c (左) レムデシビル媒介受容体活性化および (右) UT2 媒介受容体活性化に対する選択した変異の影響。EC50 値は、TGFα 放出アッセイによって決定されます。 一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定による WT に対する「ns」p  > 0.05、および **** p < 0.0001。データは平均値 ± SEM ( n  ≥ 3) として表示されます。